1. MỞ ĐẦU
2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Vector (Ghent Uni. Belgium)
Vector gắn promoter HSP 18.2
2.2. Hoá chất, thiết bị
+ Hoá chất
Thang ADN 1 kb (Fermentas)
Kit tách chiết plasmid (QIAprep Spin Miniprep Kit) của hãng QIAGEN (Đức)
Các hoá chất thông dụng khác (Carbenicillin, NaCl, yeast extract, trypton, agarose, IPTG, Xgal …) của hãng Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech
+ Thiết bị
Máy ly tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet man, máy làm khô ADN (Speed Vac), máy PCR.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phân tích trình tự promoter của gen HSP18.2 từ đó thiết kế cặp mồi đặc hiệu
Phân tích trình tự … và 3 trình tự trên NCBI AB006705.2, X17295.1, EF090413.1 kết hợp với việc sử dụng phần mềm BioEdit để so sánh các trình tự và thiết kế cặp mồi đặc hiệu nhân đoạn promoter của gen HSP18.2. Mồi xuôi (5’AtHsp18.2) có trình tự điểm cắt của KpnI ở đầu 5’, mồi ngược (3’AtHsp18.2 ) có trình tự điểm cắt của SpeI ở đầu 3’. Đoạn promoter sẽ được chuyển vào vector chuyển gen pCB-TMV mở vòng bằng hai enzyme KpnI và SpeI.
2.3.2. Phân lập promoter cảm ứng nhiệt của gen HSP18.2
2.3.2.1. Phản ứng PCR nhân đoạn promoter HSP 18.2 từ plasmid pDON221-Hsp18.2
PCR (Phản ứng chuỗi trùng hợp) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA. Đoạn promoter HSP 18.2 được nhân lên bằng PCR bằng cặp mồi đặc hiệu.
Thành phần phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt được thể hiện ở Bảng 1 và 2. DNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR là plasmid pDON221-Hsp18.2

Bảng 1. Thành phần phản ứng PCR
STT
Thành phần
Thể tích (µl)

1
2
3
4
5
6
7

8
Nước cất khử ion, khử trùng
Dung dịch đệm (10X)
25 mM MgCl2
10 mM dNTPs
5’AtHsp18.2 (10 pmol)
3’AtHsp18.2 (10 pmol)
Dream Taq polymerase (5U/ µl)
DNA plasmid (2ng/ µl)
25,6
5
5
4
3
3
0,4

4


Tổng
50


Bảng 2. Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR
Bước
Phản ứng
Nhiệt độ (0C)
Thời gian
Chu kỳ

1
2
3
4
5
6
Biến tính
Biến tính
Gắn mồi
Kéo dài chuỗi
Hoàn tất kéo dài
Kết thúc phản ứng
94
94
55
72
72
4
3 phút
50 giây
30 giây
1phút
10 phút
(
1

25

1

 2.3.2.2. Dòng hóa promoter HSP 18.2
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%. Sau đó được làm sạch (thôi gel) theo bộ Kit QIAquick Gel Extraction và gắn vào plasmid tách dòng pBT. Các bước tiến hành như sau:
- Thôi gel sản phẩm PCR: Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% và cắt lấy băng quan tâm, có kích thước khoảng 680bp. Bổ sung dung dịch QG theo tỷ lệ: Vmẫu : VQG = 1 : 3 (1(l tương ứng với 1mg mẫu). Ủ ở 500C trong 15 phút, 3 phút trộn mẫu nhẹ một lần, sau khi gel tan hết ủ thêm 5 phút cho gel tan hoàn toàn. Chuyển hỗn hợp dung dịch lên cột thôi gel, ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua cột. Bổ sung 500(l dung dịch QG, ly tâm 13.000 v/p 1 phút. Thêm 750(l dung dịch PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1 phút để loại bỏ hết dung dịch PE. Hoà tan DNA trong 30 – 50(l nước cất hoặc dung dịch EB, đã được làm ấm đến 500C, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, sau đó ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút.
- Gắn promoter HSP 18.2 vào plasmid tách dòng pBT: Sản phẩm thôi gel được gắn vào plasmid tách dòng pBT.
Bảng 3. Thành phần phản ứng gắn promoter vào plasmid
STT
Thành phần
Thể tích ((l)

1
2